Tratamiento de la Degeneración Macular Asociada a la Edad (DMAE-Hope).

El equipo del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), dirigido por el Prof. Shomi Bhattacharya, y entre cuyos colaboradores figuran los doctores Francisco Javier Diaz Corrales y Berta de la Cerda Haynes, ha preparado un proyecto de investigación para la curación de la DMAE. Se llama AMD-HOPE (Esperanza para la DMAE).

Y desde la Asociación MÁCULA RETINA nos sentimos orgullosos de haber sido impulsores y colaboradores necesarios, por medio de las aportaciones de diferente tipo que hemos ido realizando, y que esperamos poder seguir haciendo.

Os adelantamos un texto resumido de Proyecto:

RESUMEN:

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es la primera causa de ceguera del adulto. La prevalencia de esta enfermedad es del 3,3% en la población mayor de 65 años, y se estima que este valor se duplicará durante los próximos 25 años. A pesar de su alta prevalencia, hasta el momento no hay tratamientos efectivos para la variedad no exudativa de esta enfermedad (DMAE seca). Por lo tanto, es fundamental desarrollar nuevas terapias previendo el alto impacto socio-económico que representará la DMAE en un futuro cercano. Nuestro proyecto, DMAE-Hope, se centrará en el desarrollo de tres estrategias terapéuticas innovadoras utilizando las más avanzadas tecnologías para tratar de dar respuesta al problema médico que implica la falta de tratamientos para esta enfermedad. Primero, se determinará en modelos experimentales de DMAE, la seguridad y eficacia de tres “lead compounds” con alta capacidad anti-oxidante y anti-inflamatoria. Segundo, a través de la tecnología de células madres pluripotentes inducidas obtenidas de pacientes con DMAE, se determinará la viabilidad del trasplante de epitelio pigmentario de la retina dependiendo del polimorfismoCFH Y402H presente en los pacientes. Finalmente, se comprobará la seguridad y eficacia de la terapia génica en modelos de DMAE, utilizando virus adeno-asociados o nanopartículas como vectores para la liberación de genes reguladores del estrés oxidativo. El desarrollo de estas terapias innovadoras y de vectores no virales (nanomedicina) en DMAE tendrá sin duda un alto potencial de transferencia a la clínica y aplicación en la industria farmacéutica.

FINALIDAD DEL PROYECTO:

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) (MIM; 603075) es la primera causa de ceguera del adulto en el mundo occidental. Se estima que esta patología afecta a más de 9,9 millones de personas en Europa, con una prevalencia del 3,3% en la población > de 65 años (1, 2). El costo anual que genera esta enfermedad, tanto por la incapacidad física que produce en los pacientes como por los gastos sanitarios asociados al tratamiento, excede los 26 billones de euros y en España puede alcanzar los 0,671 billones de euros anuales (3). El costo médico es similar al de otras enfermedades como el Alzheimer, y el grado de incapacidad y pérdida de calidad de vida de un paciente con DMAE es comparable al que se produce en un paciente con secuelas de ictus cerebral, cáncer o patología cardiovascular severa (4). Durante las últimas décadas, la prevalencia de esta enfermedad se ha ido incrementando en forma sostenida; se estima que, a nivel mundial, para el año 2020 aproximadamente 146 millones de personas sufrirán alguna forma de DMAE y esta cifra se incrementará sustancialmente a 288 millones en 2040 (2). Las causas de este fenómeno se atribuyen principalmente al incremento de la expectativa de vida en la población de los países desarrollados y a la presencia de otros factores, posiblemente medioambientales, o al incremento en el número de pacientes tratados por otras patologías oculares que anteriormente ocultaban la presencia de la DMAE. Europa no escapa a esta realidad, y es por ello que cualquier intervención encaminada a conocer más a fondo esta patología, así como el ensayo de nuevas alternativas terapéuticas deben ser objetivos prioritarios para enfrentar este reto social en salud. Sin lugar a duda, la prevalencia de la DMAE se verá incrementada por el envejecimiento y el cambio en la estructura de la población europea en los años venideros, y esto afectará en forma contundente los sistemas de salud de los países de nuestro continente, incluyendo a España.

La DMAE es una patología que se inicia con la formación de depósitos focales de lípidos y proteínas entre la membrana de Bruch y el epitelio pigmentario retiniano (EPR), conocidos como drusas (4). Drusas pequeñas pueden ser observadas en personas sanas mayores de 40 años sin ocasionar ningún síntoma, pero cuando las drusas de mayor tamaño se acumulan en torno a la mácula (área central de la retina que proporciona la agudeza visual y que permite al ojo percibir detalles finos y pequeños), el paciente puede comenzar a experimentar pérdida de la visión central, lo que le puede incapacitar para realizar actividades de la vida diaria tales como conducir o leer; incluso pueden llegar a tener dificultad para discriminar colores y reconocer rostros (4). Si la enfermedad progresa, pueden presentarse dos tipos de DMAE. En el primer tipo ocurre una degeneración de los vasos que irrigan la coroides con una neovascularización coroidal (NVC), dando lugar a hemorragias y cicatrización en la retina. Esta variedad se conoce como DMAE húmeda o exudativa y representa aproximadamente de un 10 a un 15% de los casos (5). En la otra forma de presentación clínica ocurre una pérdida marcada y focal del EPR y de los fotorreceptores originando áreas de atrofia focal conocida como atrofia geográfica (AG). A esta otra variedad se la conoce como DMAE seca o no neovascular y representa del 85 al 90% del total de casos (5). En ambas formas de presentación clínica el paciente experimenta una perdida persistente y progresiva de la aguza visual pudiendo llegar a una ceguera irreversible. Desde hace varias décadas se han experimentado una gran variedad de tratamientos para la DMAE seca, basados principalmente en drogas con propiedades anti-inflamatorias y anti-oxidantes (6). Sin embargo, lamentablemente, hasta ahora no contamos con ningún tratamiento que haya mostrado ser eficaz en revertir o enlentecer el proceso degenerativo de la retina en esta enfermedad (7, 8). En el caso de la DMAE húmeda existen algunos tratamientos a base de agentes anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y terapia fotodinámica que pueden evitar la NVC, enlenteciendo la progresión de la enfermedad. Aunque esta terapia ha mostrado cierta eficacia, una gran mayoría de los pacientes no responden al tratamiento y los síntomas empeoran hasta llegar a la completa pérdida de la visión (8).

La DMAE, al igual que otras enfermedades neurodegenerativas, parece ser producida por la interacción de factores medioambientales, predisposición genética y el envejecimiento (9). Numerosos estudios epidemiológicos han proporcionado información importante sobre la prevalencia, incidencia, historia natural y factores de riesgo de la DMAE. Dentro de los principales factores de riesgo para el desarrollo de DMAE destacan: la edad (>55 años), la historia familiar, sexo femenino, hipertensión arterial, hipercolesterolemia, arterioesclerosis y tabaquismo (10). Entre los componentes no genéticos, el envejecimiento y el tabaquismo son los factores de riesgo más consistentes. Las características del fondo de ojo (fundus) como drusas grandes, suaves y anomalías pigmentarias están asociadas con un mayor riesgo de progresión de la DMAE. Las diferencias raciales/étnicas también afectan a la prevalencia de esta enfermedad, presentando la población caucásica mayor riesgo de padecer DMAE neovascular que personas pertenecientes a la población hispana o negra (11). Por otro lado, con la aplicación de nuevas tecnologías en el área de la genética médica se ha logrado demostrar que la predisposición genética ejerce un gran impacto como factor de riesgo en el desarrollo de DMAE. En el año 2005, fue descrita la primera asociación entre el polimorfismo Y402H (rs1061170) del gen complemento factor H(CFH) y el riesgo de desarrollar DMAE. Actualmente se conoce que este polimorfismo puede observarse en casi la mitad (40-50%) de los pacientes con DMAE. A parte del gen CFH se han identificado hasta la fecha otros 19 locus con polimorfismos y variantes que incrementan el riesgo de desarrollar esta enfermedad (9,12).

Los mecanismos moleculares exactos por medio de los cuales estos genes pueden llevar a la formación de las drusas y al desarrollo de la DMAE siguen siendo desconocidos. Se sabe que el estrés oxidativo, la respuesta inflamatoria y el metabolismo de carbohidratos y lípidos están involucrados en la fisiopatología de esta enfermedad (4, 10), pero se desconoce cómo estos factores interaccionan entre sí y cómo finalmente causan la degeneración y muerte del EPR. El estrés oxidativo parece que desempeña un rol importante en el proceso de agregación de proteínas en la retina, al igual que ocurre en otras enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y el Alzheimer. Altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden ser generados en la retina a diario y quizás en una mayor proporción en los pacientes con DMAE (13). Por esta razón, el empleo de drogas con efecto anti-oxidante ha sido considerado como una de las potenciales alternativas terapéuticas en el manejo de esta patología (12). La falta de medicamentos que puedan curar o enlentecer la pérdida de visión en los pacientes con DMAE seca y el incremento progresivo de la prevalencia de esta enfermedad, han hecho que la inversión de recursos destinados a la investigación de la DMAE se hayan incrementado considerablemente durante la última década (6).

En el laboratorio de Degeneración de la Retina del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), conscientes del impacto que tendrá la DMAE en un futuro cercano, hemos decidido comenzar a invertir esfuerzos para tratar de generar conocimientos que puedan contribuir a resolver el puzle blanco de esta devastadora enfermedad. Nuestro proyecto DMAE-Hope se enfoca en el desarrollo tres terapias innovadoras. En primer lugar, vamos a ensayar el efecto terapéutico de tres compuestos con alta capacidad anti-oxidante y antiinflamatoria (CAB001, CAB002 y CAB003). El principio activo de estas drogas ha demostrado tener efectos protectores contra enfermedades relacionadas con el envejecimiento como el cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Hasta la fecha, no se han realizado estudios pre-clínicos serios para comprobar la seguridad y eficacia de los compuestos CAB001, CAB002 y CAB003 en modelos de DMAE.

En segundo lugar, en DMAE-Hope, determinaremos la viabilidad del trasplante celular de EPR diferenciado a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) obtenidas de pacientes con DMAE, con o sin polimorfismo CFH Y402H. Este polimorfismo da como resultado una sustitución-tirosina-a histidina en la posición de aminoácido 402 (Y402H) en la proteína CFH. Las personas que llevan una copia del polimorfismo CFH Y402H tienen un riesgo 2,6 veces mayor de desarrollar DMAE en comparación con personas que no tienen el polimorfismo (14). La proteína CFH ayuda a regular una parte de la respuesta inmune del cuerpo conocido como el sistema del complemento, evitando que este se active cuando no es necesario. Se ha descrito que esta proteína es secretada por el EPR y que contribuye a la migración de células del EPR in vitro (15). Actualmente se desconocen los efectos que pudiera ejercer la presencia de este polimorfismo sobre la evolución clínica de la DMAE y sobre el manejo terapéutico de la misma a través de terapia celular; conocimientos que son esenciales para poner en práctica una medicina personalizada en el tratamiento de la DMAE. El año pasado se inició en Japón el primer ensayo clínico para demostrar la seguridad del trasplante de EPR obtenido a partir de iPSCs de pacientes con DMAE (16, 17). Las iPSCs son un tipo de célula madre pluripotente artificial que es generada directamente a partir de una célula adulta, evitando así los conflictos éticos que involucran el uso de células madre embrionarias humanas. Aunque la diferenciación de EPR a partir de células madre embrionarias humanas ha sido ampliamente estudiado (18), el uso de iPSCs como fuente alternativa de células pluripotentes en terapia celular es un campo de investigación que se está consolidando y que va en vías de expandirse rápidamente. Por tal motivo, nos hemos propuesto en DMAE-Hope, estandarizar protocolos para la producción de EPR utilizando biomatrices de biopolímeros humanos y libres de productos xenogénicos (xeno-free) que puedan garantizar la aplicación futura de las IPSCs en la práctica clínica.

Por último, evaluaremos la seguridad y eficacia de la sobre-expresión de dos genes involucrados en el manejo del estrés oxidativo en la retina (CAB004 y CAB005). Mutaciones en estos genes puede producir degeneración de la retina y neurodegeneración debida a estrés oxidativo. La sobre-expresión de estos dos genesse presenta como una opción terapéutica atractiva para ser probada en modelos experimentales de DMAE seca. Para la liberación de estos genes se utilizarán tanto virus adeno-asociados (AAV) del serotipo 2 como nanopartículas a base de polímeros naturales. DMAE-Hope aplicará técnicas novedosas de experimentación, reprogramación celular, terapias avanzadas y nanomedicina para tratar de dar respuesta al problema que constituye la falta de medicamentos eficaces para el tratamiento de la DMAE seca.

Para facilitar el cumplimiento de nuestros objetivos, DMAE-Hope ha sido dividido en tres paquetes de trabajo los cuales se describen a continuación.

  • Paquete de Trabajo 1 (PT1): Determinación de la seguridad y eficacia del tratamiento con CAB001, CAB002 y CAB003 en modelos experimentales de DMAE.
  • Paquete de Trabajo 2 (PT2): Producción de EPR (xeno-free) a partir de iPSCs obtenidas de muestras de sangre periférica de pacientes con DMAE con y sin polimorfismo CFH Y402H para posteriormente valorar la viabilidad, integración y función del trasplante celular en la retina de modelos experimentales de DMAE.
  • Paquete de Trabajo 3 (PT3): Evaluación de la seguridad y eficacia de la liberación de los genes CAB004 y CAB005 en la retina de modelos experimentales de DMAE, utilizando vectores virales del tipo AAV2 o vectores no virales con nanopartículas a base de polímeros naturales.

DMAE-Hope además de enfocarse en el desarrollo de nuevas terapias, contribuirá en forma sustancial en comprender las interacciones moleculares que hacen que el estrés oxidativo conduzca a la degeneración del EPR y de los fotorreceptores en la DMAE. Nuestro proyecto, cuenta con un equipo multidisciplinario de investigadores básicos y clínicos muy capacitados, tenemos todos los equipos e infraestructura necesarios y además contamos con el asesoramiento de prestigiosos investigadores europeos en DMAE; todos estos elementos permitirán cumplir los objetivos propuestos y garantizarán la creación de sinergias y la difusión internacional de nuestros resultados.

OBJETIVOS:

Objetivos del PT1:

  • OBJ 1.1: Comprobar el efecto anti-oxidante y anti-inflamatorio de los compuestos CAB001, CAB002 y CAB003 utilizando líneas celulares derivadas de EPR humano (RPE-1 y ARPE-19).
  • OBJ 1.2: Determinar la DL50 de los compuestos in vitro para estimar la dosis a utilizar en modelos experimentales de DMAE.
  • OBJ 1.3: Realizar las inyecciones subretinales de los compuestos en un modelos experimentales para demostrar su seguridad y eficacia en evaluaciones clínicas periódicas.

Objetivos del PT2:

  • OBJ 2.1: Recolectar muestras de sangre periférica de pacientes del Hospital Universitario Virgen de Macarena de Sevilla con diagnóstico de DMAE con y sin polimorfismo CFH Y402H y de controles sanos.
  • OBJ 2.2: Realizar cultivo primario de células mononucleares de sangre periférica y reprogramación a iPSCs en condiciones “xeno-free” utilizando cuatro factores de transcripción (OCT4, SOX2, KLF4 y c-Myc).
  • OBJ 2.3: Diferenciación y caracterización del EPR a través de estudios morfológicos, de histoquímica y de expresión de proteínas y genes específicos.
  • OBJ 2.4: Trasplantar el EPR obtenido de individuos con y sin el polimorfismo CFH Y402H y el EPR obtenido de individuos sanos en modelos experimentales de DMAE para determinar la integración, viabilidad y evolución del trasplante.

Objetivos del PT3:

  • OBJ 3.1: Construir y purificar los vectores con AAV2 portando el ADNc de los genes CAB004 y CAB005  humanos.
  • OBJ 3.2: Construir y caracterizar las nanopartículas con polímeros naturales portando el ADNc de los genes CAB004 y CAB005humanos.
  • OBJ 3.3: Comprobar la capacidad de transfección y toxicidad de las construcciones con los diferentes vectores utilizando las líneas celulares RPE-1 y ARPE-19.
  • OBJ 3.4: Realizar las inyecciones subretinales o intravitreas de los vectores AAV2 o de nanopartículas portando el ADNc de los genes CAB004 y CAB005 en los modelos experimentales  de DMAE y efectuar la evaluación periódica para estudiar su seguridad y eficacia.

CONSIDERACIONES GENERALES DE LOS MÉTODOS Y DISEÑO DEL PROYECTO:

  1. Diseño: Experimental para evaluar la seguridad y eficacia de nuevos medicamentos.
  2. Sujetos de estudio: Cultivos celulares de EPR derivado de humano. Líneas celulares RPE-1 (ATCC CRL-4000) y ARPE-19 (ATCC CRL-2302). Modelos experimentales de DMAE. Para la producción de iPSCs, se obtendrán muestras de sangre periférica de cinco pacientes con diagnóstico clínico DMAE seca en quienes se determinará la presencia o no del polimorfismo CFH Y402H por estudio de SNPs. Igualmente se tomaran muestras de controles sanos.
  3. Variables: En cultivos celulares (RPE-1 y ARPE-19) se evaluarán: la producción de ROS, marcadores de inflamación, actividad de caspasa-3, test de viabilidad celular a través de WST1 tanto en los grupos tratados CAB001, CAB002 y CAB003 como en las células infectadas con los AAV2 o transfectadas con las nanopartículas portando los genes CAB004 y CAB005.

En los modelos experimentales se valorará la morfología del fundus, la visión espacial, la percepción de contraste, la respuesta eléctrica de la retina a estímulos lumínicos, el grosor de la retina y finalmente se realizará la evaluación histológica y de expresión de genes y proteínas.

Para la valoración de los trasplantes de EPR se evaluará la capacidad de integración, viabilidad y funcionalidad del trasplante a través de estudios morfológicos. Además, se realizaran estudios electrofisiológicos para valorar la amplitud de la onda-c del electroretinograma. También en estos modelos experimentales se evaluarán las mismas variables utilizadas para determinar la seguridad y eficacia del tratamiento con los compuestos y de terapia génica.

El análisis estadístico de los datos se realizará utilizando el software IBM-SPSS. Para el análisis estadístico de variables cualitativas se utilizará chicuadrado y para las cuantitativas t-test o ANOVA dependiendo del número de grupos.